Unieśmiertelniona linia komórek nabłonkowych bydlęcego gruczołu mlekowego (MAC-T) – analiza proteomiczna komórek hodowanych w medium suplementowanym Paneksyną

I. Wstęp ……….4

II. Cel pracy ……….6

III. Przegląd piśmiennictwa
3.1. Hodowle komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego (MEC) ……….7
3.2. Hodowle pierwotne komórek epitelialnych gruczołu mlekowego (PMEC) ……….8
3.2.1. Hodowle komórek gruczołu mlekowego typu 2D ……….9
3.2.1.1. Hodowle jednowarstwowe komórek nabłonkowych koziego gruczołu mlekowego (CMEC)………. 9
3.2.1.2. Hodowle jednowarstwowe komórek nabłonkowych bydlęcego gruczołu mlekowego (BMEC………. 9
3.2.1.3. Hodowle jednowarstwowe komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego jaka (YMEC) ……….10
3.2.1.4. Hodowle jednowarstwowe komórek nabłonkowych ludzkiego gruczołu mlekowego (HMEC)………. 11
3.2.1.4.1. Linia komórkowa gruczolakoraka piersi MCF-7 ……….11
3.3. Trójwymiarowe (3D) hodowle komórek epitelialnych ……….11
3.3.1. Organoidy – przestrzenne hodowle komórek nabłonkowych ……….12
3.4. Ustalone i immortalizowane linie bydlęcych komórek gruczołu mlekowego ……….13
3.4.1. Linia komórek MAC-T ……….13
3.4.2. Inne linie bydlęcych komórek gruczołu mlekowego ……….16
3.5. Badania proteomiczne – zarys ogólny ……….17
3.5.1. Badania proteomiczne w kontekście poznania fizjologii gruczołu mlekowego ……….17
3.5.2. Kierunek wykorzystania analiz proteomicznych w hodowlach komórek gruczołu mlekowego ……….19

IV. Materiał i metody
4.1. Materiał ……….21
4.1.1. Charakterystyka materiału badawczego ……….21
4.2. Metodyka badań………. 21
4.2.1. Hodowla komórek linii MAC-T ……….21
4.2.2. Adaptacja hodowli komórek MAC-T do wzrostu w medium suplementowanym Paneksyną ……….22
4.2.3. Plan przeprowadzonego doświadczenia ……….23
4.2.4. Izolacja białka całkowitego wg. Srivastava (metoda I)………. 24
4.2.4.1. Etap I – Założenie hodowli komórkowej………. 24
4.2.4.2. Etap II – Izolacja białka całkowitego………. 25
4.2.5. Izolacja białka całkowitego wg. (Simões i in. 2013) (metoda II)………. 27
4.2.6. Oznaczanie koncentracji białka………. 28
4.2.7. Elektroforeza w warunkach denaturujących SDS-PAGE (ang. sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)………. 29
4.2.8. Elektroforeza dwukierunkowa (2-DE)……….30
4.2.9. Analiza spektrometryczna MALDI-TOF ……….32

V. Wyniki i ich omówienie
5.1. Morfologia linii komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego bydła MAC-T………. 33
5.2. Porównanie metod izolacji białka całkowitego: metoda I (wg. Srivastava) oraz metoda II (wg. Simões i in. 2013) ……….34
5.3. Ocena ilościowa wyizolowanego białka całkowitego (metoda Bradford) ……….35
5.4. Ocena jakościowa wyizolowanego białka całkowitego (Elektroforeza SDS-PAGE)………. 36
5.5. Elektroforeza dwukierunkowa (2-DE) ……….36
5.6. Analiza proteomiczna MALDI-TOF ……….37

Podsumowanie i wnioski ……….67
Piśmiennictwo ……….68
Wykaz tabel i rycin ……….74